Analyse af medicinsk cannabis

I januar 2018 blev det lovligt for virksomheder i Danmark at producere/importere medicinsk cannabis til Danmark. Dette har givet en forøget efterspørgsel for regler og udstyr, der skal bruges for at kontrollere medicinsk cannabis. Dette FOKUS uddyber lægemiddelstyrelsens standard for at give en bedre forståelse af de analyser samt redskaber, der skal bruges for at kunne producere medicinsk cannabis efter de danske regler.

Cannabis kommer fra hampplanten. Cannabis sativa er den plante, som størstedelen af de forskellige cannabisprodukter bliver udvundet fra. Cannabis sativa er en plante af cannabisslægten, som er en del af hampefamilien. Der findes flere forskellige typer af cannabisplanter. Cannabis sativa kaldes også ’almindelig hamp’. Brug af cannabis er forbudt i Danmark, med mindre det er ordineret som medicin af en læge. Cannabis har igennem århundreder været brugt til medicinske formål og som rusmiddel. Cannabinoider kan påvirke centralnervesystemet og f.eks. reducere spasmer og virke smertestillende. De bedst kendte virkninger ved cannabinoider er de såkaldte ’psykoaktive’ virkninger, hvilket vil sige følelsen af at blive 'høj' eller 'skæv'. Cannabinoider er de aktive stoffer, der findes i cannabisplanten. Der er mere end 100 forskellige cannabinoider i cannabis, herunder f.eks. CBD og THC.

THC står for delta-9-tetrahydrocannabinol og er det vigtigste euforiserende stof i cannabis. Hvis man bruger medicin med THC i, skal lægen vurdere, om man må køre bil. THC har en positiv indvirkning på smerter (kroniske og neuropatiske) samt på appetit, kvalme og opkast i forbindelse med kemoterapi.

CBD står for cannabidiol og er det hyppigste aktive stof (cannabinoid) i cannabis. CBD er ikke et euforiserende stof i modsætning til THC. CBD virker muskelafslappende og smertestillende. (kilde: Kræftens bekæmpelse)

Dette FOKUS er en beskrivelse af Danske Lægemiddelstandarder til at analysere cannabis blomsten (Drogen). Her er alle relevante analysemetoder beskrevet, for at give et overblik over de forskellige krav cannabis blomsten skal overholde, før den tillades til medicinsk brug. Der er taget udgangspunkt i lægemiddelstyrelsens monografi af cannabis blomst  (Lægemiddelstandarder 2018.0 bilag 7). Den nævnte monografi refererer til flere standardtyper, herunder Den Europæiske Farmakopé(Ph.Eur.)  samt EN/DS, der beskriver forskellige standarder til metoder, reaktanter og udstyr, som bruges i de nævnte analyser i teksten. For at få en dybere forståelse end det her beskrevne, skal de nævnte Ph.Eur. og EN/DS købes. Der må også bruges andre metoder end nævnt i denne artikel, dette kræver dog, at der søges om dette hos Lægemiddelstyrelsen, samt at der eftervises resultater, der beviser at metoden virker.

Prøveforberedelse til cannabisanalyse

Der er på nuværende tidspunkt sat mest fokus på, hvordan drogen skal kontrolleres. Her har Lægemiddelstyrelsen lavet en række krav og guider til, hvordan drogen (blomster hovedet) skal analyseres for at få en homogen analyse, og derved konkrete resultater. Nedenfor kan der ses de trin, som drogen skal igennem. Der er to kategorier: Først en overordnet analyse af drogen som et helt objekt og dernæst en mere grundig analyse af indholdet af drogen. Det er alle analyser, der tilsammen giver drogens karakteristika. Her beskrives de procedurer, som ikke har med analysen at gøre, men den viden og det forarbejde, der skal gøres for at kunne analysere drogen i de senere analyser.

Stikprøver af batch (Ph.Eur.2.8.20.)

For at kunne afgøre antallet af prøver, der skal tages per batch, er der lavet en standard med tabel og formel (Ph.Eur.2.8.20.), der bruges som et opslagsværk. Her bliver mængden samt antal stikprøver vurderet ud fra batchstørrelsen og det antal beholdere, der skal bruges i en batch. Dette er lavet for at give en fornuftig mængde analyser af batchen. Proceduren kan ses på Ph.Eur.2.8.20. Til denne del skal der bruges: Vægt

Cannabispulver (Ph.Eur.2.1.4.) (Lægemiddelstyrelsen)

Ved pulverisering af cannabisblomsten, vil der være en stor mulighed, for at der sker tab af de aktive materialer under processen. Dette skyldes, at cannabissens kirtelhår og resinen fra kirtelhårene klister sig fast til de redskaber, der bruges til at pulverisere cannabispulveret. Cannabispulveret skal have en sigtestørrelse på omkring 5 mm. Her skal der bruges en sigte 5600, der holder standarden indenfor Ph.Eur. 2.1.4. for at give en mere homogen analyse. Dette cannabispulver bruges til alle senere analyser, hvor der skal bruges pulveriseret cannabis. Til fremstilling af cannabispulver skal der bruges: Hakkemaskine/blender, vægt, vejebåd, sigte (5600)

Grænser (Lægemiddelstyrelsen)

Under de forskellige analyser er det vigtigt at huske, at CBN (cannabinol) maksimalt må være på 1,0 % og at rapporteringsgrænsen ligger på 0,05 %. Hvis CBN-indholdet eksempelvis ligger på 0,05 %, skal det indberettes som højst 0,05 %. Derudover skal andre eventuelle relevante indholdsstoffer og urenheder fremgå af specifikationen.  

Opbevaring (Lægemiddelstyrelsen)

For at sikre gode resultater, er det vigtig at tænke over, hvordan cannabisprøver bliver opbevaret. Prøverne skal være beskyttet mod lys og fugt i lufttætte emballager. Cannabis kan udskille harpiks, som kan absorberes af bestemte overflader samt trænge igennem og ind i plastik. Derfor skal der tænkes over, hvilken emballage der bruges. Et eksempel kan være brune vials.

Væskekromatografi analyser (Lægemiddelstyrelsen)

For at sikre valide resultater må der højst være en 2 % afvigelse af retentionstiderne på testopløsningerne og de tilsvarende stoffer, der måles i referenceprøverne. Vedrørende UV spektralprofiler, så skal der være en match faktor på mindst 950. For en mere sikker identifikation af de enkelte toppe, kan testopløsningen med fordel spikes med passende mængder af referencestandarder i samme størrelsesorden, som indholdet af substanserne i testopløsningen.

Analyser udført på ubehandlet droge

I de analysemetoder, der er beskrevet i dette afsnit, analyseres der direkte på drogen, som det er beskrevet i metoderne.

Makroskopisk udseende (Lægemiddelstyrelsen)

Cannabisblomsten indsamles som smågrene i længder mellem 1,5 - 5 cm. Nogle gange også som tørrede blomsterstande fra den hunlige plante, også kaldet topskuddet. Her undersøges delene ud fra Lægemiddelstandarder 2018.0 bilag 7, omkring analyse af mikroskopiske udseende. Analysen laves, da der ses nogle variationer alt efter, hvordan cannabissen er dyrket, og dette kan give forskellige karaktertræk, såsom størrelse, farve og så videre. Blomsterdelene, der sidder fast med hinanden, opløses i 70 % ethanol, hvorved harpiksen opløses. Herefter renses topskuddet med vand for at skylde ethanolen og harpiksen væk. Cannabis, renset i ethanol, må ikke bruges til senere analyser, da nogle af indholdsstofferne forsvinder under denne proces.

Mikroskopiske egenskaber (Lægemiddelstyrelsen)

Ved mikroskopiske undersøgelser, skal topskuddet først deles i passende stykker, så de passer til mikroskopi. Efter eget valg kan blade, dækblade og grene indlejres i enten vand, ethanol eller kloralhydrat opløsning. Her undersøges delene ud fra Lægemiddelstandarder 2018.0 bilag 7, for analyse af mikroskopisk udseende. Til mikroskopiske egenskaber skal der bruges: Lup/mikroskop, petriskåle

Fremmede bestanddele (Ph.Eur.2.8.2.) (Lægemiddelstyrelsen)

Der må ikke være nogle fremmede bestanddele på drogen. Fremmede elementer kan opdeles i 2 områder:

  • Fremmede organer - Dele fra planten, som ikke hører til medicinen.
  • Fremmede elementer som animalske forureninger - Ting der kommer fra fremmede dyr, insekter, svampe og lignende.

For at undersøge mængden af fremmede dele i drogen, afvejes der 100-500 gram. Delene spredes ud i et tyndt lag og undersøges for fremmede elementer med øjet og evt. en 6x lup. Alle fremmede dele separeres fra drogen og vejes herefter. For cannabis er der vedtaget, at det er max. 2 % af den samlede prøvevægt, som må være fremmedlegemer. Derudover må ingen blade skyde mere end 20 % af blomstens længde. Stilke skæres væk under den nederste blomst, da denne stilk betragtes som et fremmedlegeme. Dog må der ses væk fra op til 2 % stilke, der er længere end 2,0 cm og højst 20 % stilke, der er længere end 1,5 cm. Til at undersøge for fremmede dele, skal der bruges: Vægt, vejebåd, lup x6

 

Analyser udført på pulveriseret droge

I de analysemetoder der er beskrevet i dette afsnit, analyseres der på pulveriseret droge. Metoden for pulverisering står i tidligere afsnit. I alle metoder, skal det som udgangspunkt være pulveriseret droge fra samme batch der bruges.

Mikrobiel renhed (Ph. Eur. 5.1.8. eller Ph. Eur. 5.1.4)

I analysen af mikrobiel renhed af drogen skal der undersøges om niveauet af TAMC og TYMC er under grænseværdierne, hvilke er forskellige alt efter hvilket produkt, der skal laves af cannabis (Se Ph. Eur. 5.1.8. eller Ph. Eur. 5.1.4). Dette undersøges ved at homogenisere en bestemt mængde droge med en laboratorieblender. Fortynd drogen 1:10 med forvarmet klorid-peptone (pH 7,0) eller fosfatbuffer opløsning (pH 7,2) og ryst det så homogent som muligt. Lav efterfølgende fortyndingerne 10^2 -10^6, hvor der fortyndes med den samme buffer, som der blev brugt til 10^1. Brug et 0,45µm filter til at overføre 1 ml prøve til en petriskål. Der laves duplikater for at sikre resultatet. Petriskålene skal indeholde 2 forskellige typer agar. Ved TAMC måling skal der være casein soya bean digest agar og ved TYMC måling skal der være Sabouraud-dextrose agar. Link til opskrifter på agar  

Sæt låg på petriskålene og placer dem i en inkubator ved følgende temperaturer; TAMC (30-35 °C, 3-5 dage), TYMC (20-25°C, 5-7 dage). Inkuber også en negativ prøve ved siden af de andre prøver for at kontrollere mod kontaminering. Efter inkubering tages prøverne ud, og der findes en fortynding, hvor der højst er 250 kolonier for TAMC og højst 50 kolonier for TYMC. Tæl mængden af den fortynding og tag gennemsnittet af de 2 prøver. Brug herefter nedenstående formel til at udregne renheden: (fortynding x KIM)/(volumen i ml). Til mikrobiel renhed bruges der: Reagensglas, varmeovn (Inkubator), lysplade, pipetter, filter, vortexmikser, blender, vægt

Aflatoxiner (Ph.Eur.2.8.18.)

Da aflatoxiner er meget giftige, skal der udvises høj forsigtighed under analysen. Her vil der kunne bruges stinkskab evt. handskeboks/pose, hvis niveauet er ukendt. Analysen kan ske via HPLC, hvor der bruges 1 gram cannabispulver, der skal opløses i en 100 ml blanding af metanol og vand (70/30) ved sonikering (ultralyd) i 30 min. Herefter kan der udtages en prøve til analyse på HPLC. Der laves en kalibreringskurve for at kunne omregne til en mængde af aflatoxin B1. Der laves 6 standardopløsninger for at kunne præcisere mængden. Det er vigtigt, at der ved fremstilling af opløsninger tages hensyn til, at aflatoxin B1 er giftigt. Efter analyse af prøveopløsningen og kalibreringskurven kan nedenstående formel bruges til at udregne koncentrationen: (A x B x 10.000)/(C x (100-D)) = indhold af aflatoxin 

A = Koncentration af aflatoxin i prøveopløsningen i mg/ml, som beregnet ved anvendelse af en kalibreringskurve

B = Renheden af aflatoxin-standarden i %

C = Mængde af droge anvendt til at fremstille prøveopløsningen, i gram.

D = Vandindhold i drogen i %

Eksempler på HPLC analyser af aflatoxin B1. Under linket kan det ses hvilke forhold, der er brugt til at lave analyserne. NUCLEODUR® C18 Gravity-SB eller NUCLEOSHELL® PFP. Til analyse af aflatoxiner bruges der: (Stinkskab), HPLC, kolonne, ultralydreferencestandard (aflatoxiner), måleglas, reagensglas, pipetter

Pesticider (Ph.Eur.2.8.13.) (EN/DS 15662:2018)

Til at måle pesticider i fødevarer og planter (QuEChERS ekstraktion), vil metoden i EN/DS 15662:2018 kunne bruges. Se standarden for mere information. Afhængig af cannabissens egenskaber skal der bruges forskellige forhold af ingredienser, dette står uddybet i EN/DS 15662:2018. Et eksempel på en prøve er, at der vejes 1 gram cannabispulver af og blandes med 14 ml demineraliseret vand. Cannabispulveret opløses i 1 time under omrystning. Der tilføjes 15 ml acetonitril (med 1% eddikesyre) og omrystes i 1 min. Tilføj buffer (4 gram magnesium sulfat, 0,05 gram sodium chloride, 0,05 gram trisodium citrate, 0,03 gram disodium hydrogencitrate sesquihydrate). Alt blandes sammen med 10 ml vand og rystes i 1 min. før prøven centrifugeres i 5 min. ved 3000g. Herefter tages supernatanten (10 ml), som enten kan analyseres på HPLC eller der kan oprenses igen med buffer og centrifugering, hvis der er flere urenheder. Før HPLC analysen filtreres prøven igennem 0,45µm filter. Der kan bruges en NUCLEODUR® C18 Gravity-SB (se lignende eksempel i dette link eller andre kolonner), til at analysere pesticider i prøverne. Der laves en kalibreringskurve af en kendt pesticidstamopløsning. Link til grænseværdierne for pesticider i prøven. Til pesticid måling bruges der: HPLC, kolonne, centrifuge, vortexmikser, centrifugerør, reagensglas, måleglas, bægerglas, pipetter, vægt, referencestandard pesticid

Tørringstab (Ph.Eur.2.2.32.)

Afmål 0,500 gram cannabispulver og kom det i et bæger. Placer bægeret med cannabispulveret i en vakuumovn/eksikator sammen med diphosphorpentoxid, som skal bruges til at absorbere vandet fra cannabispulveret. Mængden af diphosphorpentoxid er underordnet, så længe der er nok i forhold til vandindholdet. Diphosphorpentoxid kan genbruges, så længe det stadig er i pulver stadiet, det andet fjernes. Sæt vakuumovnen/eksikatoren til 40 °C og et tryk på mellem 1.5- 2.5 kPa. Lad cannabispulveret tørre i 24 timer. Mål derefter vægttabet af cannabispulveret. Der må højst være et tab på 10%, hvis tabet er højere, skal der laves en bestemmelse af vandindhold, se næste metode, for en beskrivelse. Til tørringstab bruges der: Vægt, vakuumovn/eksikator + varme, vejebåd

Bestemmelse af vandindhold (Ph.Eur.2.2.13)

Denne metode skal bruges i stedet for tørringstabsmetoden, hvis cannabissen indeholder mere end 10 ml/kg (1%) æterisk olie. Rens destillationssystemet med vand og tør det inden brug. Tilsæt 200 ml toluene og 2 ml vand i en kolbe. Tilslut kolben til destillationssystemet (se figur for eksempel) og tilføj en varmekilde; enten en elektrisk varmekilde med potentiometer eller et oliebad, hvor varmen kan kontrolleres. Destiller i 2 timer og lad derefter destillationen køle ned i 30 min. Aflæs mængden af vand i forhold til den nærmeste værdi af 0,05 ml. Tilføj en mængde af cannabispulveret i destillationskolben, så det passer med en mængde mellem 2 og 3 ml vand med 1 % nøjagtighed.

Når toluen begynder at koge, skal det destillere med en hastighed på 2 dråber per sekund. Denne hastighed følges indtil størstedelen af vandet er væk, herefter øges hastigheden til 4 dråber per sekund i stedet. Når det sidste vand er væk, renses kondensoren (del C på figuren) med toluen, hvorefter der destilleres i yderligere 5 min. Lad derefter destillation køle ned til rumtemperatur og hjælp vandet, der stadig klæber til glasset med at blive løsrevet. Når alt vand og toluen er separeret fra hinanden, skal mængden af vand bruges til at udregne vandindholdet (antal milliliter per kg) ved at bruge denne formel: (1000 (n2 - n1))/m  

m = Antal gram af prøven

n1 = Antal ml vand fra første prøve

n2 = Antal ml vand fra anden prøve

Til bestemmelse af vandindhold, skal der bruges: Destillationssæt, varmekilde

Tungmetaller (Ph.Eur.2.4.27.)

Tungmetaller kan analyseres via atomabsorptionsspektroskopi, der måler tungmetallernes lys, når atomerne afbrændes. Her er det tungmetaller som cadmium (max 1,0 ppm) bly (max 5,0 ppm) og kviksølv (max 0,1 ppm) der skal holdes øje med. Dog skal der også undersøges for andre tungmetaller, da cannabis kan ophobe tungmetaller via bioakkumulation. Dette afhænger af dyrkningsmetoden. Det vil være mulighed for at få analyseret tungmetaller hos kommercielle virksomheder.

Total aske (Ph.Eur.2.4.16.)

For at sikre renhed i prøven skal en smeltedigel lavet af enten platinium eller silica varmes op indtil den er rødglødende i 30 min. Efterfølgende placeres diglen i eksikator til afkøling, hvorefter den vejes. Tilføj 1,00 gram cannabispulver til smeltediglen. Opvarm diglen med cannabispulveret i en time med en temperatur mellem 100-105 °C. Varm derefter cannabispulvert op indtil det opnår en konstant vægt i en muffelovn ved 600 °C ± 25 °C, derefter køles den ned i en eksikator. Efter at prøven er afkølet vejes den på en vægt, for at undersøge om den har opnået konstant vægt. Denne procedure gentages, hvis det ikke er opnået. Cannabispulveret skal ikke antændes under processen. Hvis der er nogle sorte partikler efterfølgende, skal prøven blandes med noget varmt vand og derefter filtreres gennem askefri papir. Filteret og prøven, opvarmes derefter igen i en muffelovn ved 600 °C ± 25 °C ved samme procedure som før nævnt, indtil der er opnået konstant vægt. Indholdet af aske må maksimalt svare til 10% af prøven. Til total aske skal der bruges: Smeltedigel, eksikator, muffelovn, vægt, askefrit papir

Væskekromatografi (Ph.Eur.2.2.29.)

For at kunne bestemme indholdet af forskellige cannabinoider, skal der laves HPLC analyse af cannabispulveret sammen med kalibreringskurver for at bestemme tilstedeværelsen samt niveauet. 1,000 gram cannabispulver blandes med 40 ml ethanol og omrystes i 15 min. ved ca. 300 rpm. Derefter centrifugeres der ved 3000 rpm. Supernantanten fra prøven hældes over i et målebæger og resten af cannabispulveret ekstraheres 2 gange mere med 25 ml ethanol. Al supernantant samles i målebægret, og der fyldes op med ethanol indtil, der  samlet er 100 ml i målebægret. Opløsningen filtreres gennem først et papirfilter og dernæst et PTFE-membranfilter med en porestørrelse på 0,45µm. Der udtages 1 ml af den filtrerede væske og fortyndes til 9 ml med en blanding af mobil fase A (7 dele opløsning af 0,1% eddikesyre i acetonitril) og mobil fase B (3 dele 0,1% eddikesyre i vand). Dette ender ud i en 10x opløsning som kaldes testopløsning 1. Den skal bruges til analyser af Δ 9-THC, Δ8-THC, CBD og CBN for at beregne indholdet af stofferne sammenlignet med referenceprøver. Der tages 1 ml af testopløsning 1 og fortyndes til 9 ml med solvent. Dette ender ud i en 100x opløsning som kaldes testopløsning 2. Den skal bruges til analyser af THCA og CBDA for at beregne indholdet af stofferne sammenlignet med referenceprøver. Der laves kalibreringskurver af alle cannabinoider, der skal undersøges for i testopløsningerne, for at kunne beregne indholdet af de forskellige stoffer. Der laves 6 koncentrationer mellem 0,05-0,5 mg/ml ud fra referenceopløsningerne til kalibreringskurverne. Referenceopløsningerne fortyndes i methanol. Nedenunder kan der ses nogle eksempler på retentionstider for cannabinoiderne med en YMC-Triart C18 kolonne. Dette kan give en indikation om, hvornår toppen for en bestemt cannabinoide vil elueres i kromatogramet.

Substans

Relativ retentionstid [min] (ca.)

CBDA

8-8:30

CBD

9-9:30

CBN

13-13:30

Δ 9-THC

16-16:30

Δ 8-THC

16:30-17

THCA

20:30-21

Cirka retentionstider for forskellige cannabinoider med en YMC-Triart C18 kolonne.

Kromatogram af forskellige cannabinoider med en YMC-Triart C18 kolonne.

Følgende er brugt til HPLC resultatet vist ovenover YMC-Triart C18 - analyseparametre. Efter HPLC analysen med testopløsningerne og kalibreringskurverne, kan der udregnes indhold af de forskellige cannabinoider. Formler til udregning af forskellige cannabinoider. Til væskekromatografi bruges der:  HPLC, kolonne, centrifuge, vortexmikser, solventer, referenceopløsninger, papirfilter, PTFE-membran filter 0,45 µm, pipette med tilbehør

Ordliste:

Lægemiddelstyrelsen + Ph.Eur + EN/DS

Δ 9-THC:                           delta-9-Tetrahydrocannabinol

Δ 8-THC:                           delta-8-Tetrahydrocannabinol

THCA:                                Tetrahydrocannabinolsyre

CBD:                                  Cannabidiol

CBDA:                                Cannabidiolsyre

CBN:                                  Cannabinol

cm:                                     centimeter

Ph. Eur. :                            Den Europæiske Farmakopé

mg:                                     milligram

min. :                                  minut(ter)

ml:                                      milliliter

mm:                                    millimeter

µL:                                      mikroliter

PDA:                                   fotodiode array

PTFE:                                  Polytetrafluoroethylen (“Teflon”)

rpm:                                   rotationer i minuttet

RRT:                                    Relativ retentionstid

RSD:                                   Relativ standardafvigelse

HPLC:                                 High Performance Liquid Chromatography eller Væskekromatografi

UHPLC:                              Væskekromatografi med ultrahøj ydeevne

UV:                                     Ultraviolet

DS:                                     Dansk standard

TYMC:                                Total Yeast Microbial Count

TAMC:                                Total Aerobic Microbial Count

 

Materialet til denne FOKUS side er indsamlet af Bjarke Haagensen.

Der tages forbehold for materialet/oplysningernes rigtighed og oprindelse.

Herunder findes en samlet linkliste til produktgrupperne samt forslag til produkter

Vægt - PHO BTG6001

Centrifuge - AHN 7001010

Vortexmikser -  PHO RSVF10

Eksikator/vakuum - DU 247835753

Varmeovn (Inkubator) - PHO TININ16B

Mikroskop - Lysmikroskop

Ultralyd - Sonikator

Varmekilde - PHO RSM01HP

Pipette med tilbehør - VL 33332

 

Brune vials - LP 20091690

Destillationssæt - Dean Stark Destillation

Petriskåle - DU 1184071

CentrifugerørAHN 3208C50

Reagensglas - DU 261101302

Måleglas - DU 213902402

Bægerglas - DU 211163602

 

Vejebåd - MN 486000

Papirfilter - MN 152020

PTFE-membran filter 0,45 µm, - MN 729205

Filter - MN 729025

Solventer - ethanol - methanol - acetonitril - eddikesyre

Referencestandarder -  CHR 00099

HPLC og kolonner - YMC Triart C18, NUCLEODUR® C18 Gravity-SB og NUCLEOSHELL® PFP

Copyright © 2017 Mikrolab Aarhus A/S. All rights reserved.